Семейство хеморепеллентов, семафорины
СЕМЕЙСТВО ХЕМОРЕПЕЛЛЕНТОВ, СЕМАФОРИНЫСемейство хеморепеллентов, семафориныДругими белками, которые играют роль хеморепеллентов, являются семафорины, большое семейство секреторных и трансмембранных белков (рис. 1А). Первоначально они были идентифицированы как факторы, управляющие ростом аксона у кузнечиков, и были признаны хеморепеллентами. Затем был обнаружен и выделен в чистом виде гомолог этого белка у позвоночных, коллапсин-1, который, как было показано, приводит к ретракции конусов роста в культуре клеток. Он также способен управлять на длинных дистанциях ростом аксона, вызывая его отклонения. Нейропилины являются высококонсервативным семейством рецепторов к семафоринам (рис. 1В).Модуляция ответов на хеморепелленты и хемоаттрактантыНа пути передачи сигналов, которые обеспечивают ответы клетки на хемоаттрактанты и хеморепелленты, можно влиять при помощи кальций-зависимых протеинкиназ и протеинкиназ, зависящих от концентрации циклических нуклеотидов. Например, в культуре спинальных нейронов Xenopus активация пути циклических нуклеотидов более благоприятна для сигналов аттракции; ингибирование этих путей приводит к отталкиванию конуса роста. Таким образом, источник нетрина-1 притягивает конус роста культивированных спинальных нейронов Xenopus. Однако при добавлении ингибитора протеинкиназы А конусы роста поворачивали прочь от источника нетрина. С другой стороны, конусы роста Xenopus в нормальных условиях направляются прочь от источника коллапсина-1; эти отталкивающие эффекты становятся привлекающими после активации сигнальных путей, связанных с цГМФ. В среде с низким содержанием кальция исчезают все типы ответов (как привлекающие, так и отталкивающие), а скорость роста возрастает.|
| | Рис. 1АВ. Семафорины и нейропилин обеспечивают хемоаттракцию и хемоотталкивание на близких и дальних дистанциях. (А) Домен sema (полоски) характеризует все шесть классов семафоринов которые включают секреторные (II и III) и связанные с мембраной (I, IV-VI) формы. Внеклеточные регионы также содержат домены, напоминающие иммуноглобулины (кружочки), повторы тромбосподина I типа (овалы), и домены, богатые щелочными аминокислотами (полоски). Цитоплазматические домены короткие и имеют большую вариабельность. (В) Нейропилин -- рецептор семафорина. Во внеклеточном регионе домены a1 и а2 (также называемые CUB последовательностями) схожи с доменами комплементарных факторов С1а и C1s, протеином костного морфогенеза 1 и несколькими металлопротеиназами. Домены b1 и b2 повторяют домены факторов свертывания V и VIII. С область содержит МАМ домен, последовательности которого обнаружены в тирозинфосфатазе Ми, А5/нейропилине и метал лоэндопептидазе меприне. Короткий цитоплазматический конец остается высококонсервативным от вида к виду. | | |
Иннервация клетки-мишениМеханизмы управления конусов роста, описанные до сих пор, направляют аксон к его конечной цели. Однако проблема того, как каждый аксон подходит к своей клетке-мишени, остается открытой. Путь, по которому ганглиозные клетки сетчатки иннервируют свои клетки-мишени в области передних бугров покрышки, является примером того, какие сигналы обеспечивают достижение правильного паттерна иннервации. Во время развития аксоны ганглиозных клеток задней или височной (temporal) части сетчатки направляются для иннервации в переднюю часть тектума, а клетки передней (nasal) части сетчатки направляются для иннервации задней части тектума (рис. 2).|
| | Рис. 1CD. (С и D) Семафорим III (Sema3A) -- хемореппелент дальней дистанции для сенсорных аксонов. Спинальный ганглий эмбриона крысы (слева на каждой панели) культивировали в течение 48 часов рядом с агрегатами COS клеток. Белыми кружками показаны контуры ганглия. Для того чтобы вызывать рост сенсорных волокон малого диаметра в среду был добавлен ФРН. (С) Контрольные COS клетки. Аксоны растут в виде венчика. (D) COS клетки, секретирующие рекомбинантный Sema3A. Sema3A отталкивает аксоны. | | |
В элегантной серии экспериментов Бонхоеффер с коллегами продемонстрировали, что аксоны определяют территории своей иннервации посредством отталкивающих взаимодействий, которые предотвращают вторжение аксонов височной зоны в область задней части тектума. Ганглиозные клетки височной сетчатки были помещены в культуру, где рядом с ними находились поверхности, покрытые мембранами, выделенными либо из передней, либо из задней области тектума. В этих условиях аксоны отталкивались мембранами из задней части тектума и росли преимущественно в направлении мембран своих естественных мишеней, мембран передней части тектума. Любопытно, что аксоны сетчатки, не имея подобного выбора, быстро растут в направлении любого субстрата, как из передней, так и из задней части тектума.Молекулы, ответственные за такие отталкивающие взаимодействия, принадлежат к семейству рецепторов, связанных с тирозинкиназой (известных как Eph киназы), а также их лигандов (называемых эфринами, ephrines). Эфрин-А2 и эфрин-5 экспрессируются в тектуме во время образования ретинотектальных связей, и их концентрация постепенно увеличивается в направлении спереди назад. Рецептор к Eph-АЗ экспрессируется на аксонах клеток сетчатки соответственно назотемпоралыюму градиенту. При заключении в липидные пузырьки и добавлении в среду, омывающую аксоны клеток височной части сетчатки, эфрины А2 и А5 вызывают отделение конусов роста от субстратов и их ретракцию. Эфрины и семейство Eph рецепторов, связанных с тирозинкиназой, действуют во всех частях развивающейся нервной системы, влияя на нахождение пути аксоном, миграцию клеток, образование связей между ними, в основном демонстрируя сходный отталкивающий механизм.Одного рострокаудального градиента недостаточно для того, чтобы аксоны клеток сетчатки правильно достигли своего окончательного месторасположения в тектуме. Более поздние изменения в рострокаудальных проекциях основываются как на определенно расположенных химических сигналах, так и на механизмах, зависящих от активности нейроновОбразование синапсовКак только конус роста достигает своей мишени, он должен установить синаптический контакт, часто имеющий специфическое расположение на клетке-мишени. Анализ механизмов, благодаря которым формируются такие четкие связи в пределах ЦНС, является основной проблемой. Предпочтительным препаратом для изучения образования синаптических связей является нервно-мышечное соединение в скелетной мышце позвоночных.Накопление рецепторов к ацетилхолинуИсследования Фишбаха, Кохена, Шанге, Салпетера, Штайнбаха, Пу, Кидокоро и других показали, что на ранних периодах развития рецепторы АХ распределены диффузно вдоль поверхности неиннервированных мышечных волокон с плотностью около нескольких сотен рецепторов на квадратный миллиметр. По мере того как конус роста мотонейрона приближается к мышечному волокну, в клетке-мишени возникают деполяризующие потенциалы в ответ на выделение АХ из конуса роста (рис. 3.). После контакта частота спонтанного выделения квантов АХ быстро возрастает, как и величина синаптического потенциала, возникающего в ответ на стимуляцию аксона. Таким образом, в течение минут формируется функциональная сииаптическая связь.На первом этапе синаптической специализации происходит накопление рецепторов АХ (AChRs) непосредственно под терминалью аксона. Этот процесс начинается через несколько часов после первоначального контакта. Через день-два плотность рецепторов под терминалью составляет несколько тысяч на квадратный миллиметр. Примерно в то же самое время в областях синапсов начинает накапливаться ацетилхолинэстераза и становятся заметны пучки матрикса пластинки в области синаптической щели. Дальнейшая дифференцпровка нервно-мышечного соединения происходит постепенно, в течение нескольких последующих недель развития. У многих видов субъединица рецептора АХ заменяется на субъединицу, что приводит к формированию из эмбрионального рецептора рецептора взрослого типа (глава 3). Распределение рецепторов также меняется: концентрация под терминалью аксона постепенно увеличивается, достигая у взрослых уровня примерно 104 рецепторов на 1 мкм2, а плотность рецепторов вне синаптической зоны мышечных волокон уменьшается до уровня меньше чем 10 рецепторов на I мкм2. Метаболическая стабильность рецепторов АХ также меняется. До иннервации рецепторы мембраны имели период полужизни порядка 1 дня; рецепторы АХ в иннервированных волокнах удивительно стойкие, их период полужизни составляет около 10 дней.|
Рис. Быстрое образование действующих синаптических связей между аксонами мотонейронов и мышечными клетками. (А, В) Фазово-контрастные фотографии растущих нервных отростков (N) и веретеновидных миоцитов (М) в нервно-мышечной культуре клеток Xenopus в начале (А) и в конце (В) электрической регистрации. (С, D) Whole-cell patch-clamp миоцитов. Можно зарегистрировать спонтанные синаптические токи уже через I минуту после контакта (С), которые увеличиваются на несколько порядков к 18-й минуте (D). | | | |
Изменения также происходят в терминали аксона, приводя в течение нескольких недель к образованию активных зон. Эти и многие другие исследования показывают, что образование синапса не является простым событием по принципу «все или ничего». Хотя функциональная синаптическая передача может устанавливаться довольно быстро, дифференцировка пре- и постсинаптических характерных свойств -- более долгий процесс, идущий на протяжении нескольких недель развития, и он основан на обмене разнообразными молекулярными сигналами между нервной терминалью и мышечным волокном. Детальные морфологические и физиологические эксперименты показывают, что конусы роста соприкасаются с поверхностью мышечной клетки в произвольном месте, игнорируя сушествуюшие кластеры рецепторов АХ, и быстро приводят к формированию новых агрегатов рецепторов (рис. 4.).Таким образом, терминали аксона должны высвобождать некий сигнал, который индуцирует накопление рецепторов АХ на мышечной клетке. Этот сигнал является специфическим для холинергических нейронов; при прорастании нехолинергических нейронов в мышечные клетки они не вызывают изменений в распределении рецепторов АХ. Однако сигналом к этому не является сам АХ; накопление рецепторов АХ под терминалями аксона происходит в культурах клеток в присутствии кураре и бунгаротоксина, которые блокируют взаимодействие АХ с его рецепторами. В экспериментах, изначально предназначенных для идентификации сигналов, контролирующих регенерацию нервно-мышечного соединения , был идентифицирован белок, названный агрином, который высвобождался терминалями двигательного нерва и приводил к накоплению рецепторов АХ, холинэстеразы и других компонентов постсинаптического аппарата в синаптических областях.Вызванная агрином синаптическая дифференцировкаАгрин существует в нескольких изоформах, которые возникают вследствие альтернативного сплайсинга одного гена. Мотонейроны, мышечные клетки и шванновские клетки экспрессируют агрин, но только у мотонейронов агрин находится в такой изоформе, которая способна вызывать постсинаптическую дифференцировку. Агрин является большой молекулой (heparan sulfate proteoglyсап), домены которой взаимодействуют с ламииином, белками, связывающими гепарин, дистрогликаном, гепарином и интегринами (рис. 5). Способность индуцировать образование постсинаптической специализации в основном зависит от С-концевого домена.Ведущая роль агрина в формировании нервно-мышечного соединения наиболее очевидна у мышей, у которых при помощи гомологичной рекомбинации выключена экспрессия гена агрина. При таком выключении гена мышечные волокна выглядят нормально и аксон растет в направлении развивающихся мышц, однако нервно-мышечные соединения не образуются.|
| Рис. 4. Аксоны вызывают агрегацию рецепторов ацетилхолина в областях контакта с мышечными клетками. Фазово контрастные (A. В) и флуоресцентные (С, D) микрофотографии нервно-мышечной культуры клеток Xenopus. Рецепторы ацетилхолина окрашены при помощи родамин бунгаротоксина. (А, С) До и сразу после контакта на миоците имеются спонтанно образованные кластеры рецепторов АХ. (В, D) Через 24 ч спонтанно образовавшиеся области рецепторов АХ исчезли и образовались новые области непосредственно в области аксонального контакта. | | |
Подобный же фенотип наблюдается у мышей, у которых выключен синтез мышечно-специфического рецептора тирозинкиназы MuSK. Это наводит на мысль, что MuSK формирует часть рецептора к агрину и что вызванное агрином аутофосфорилирование MuSK запускает внутриклеточный сигнальный каскад, который приводит к формированию необходимых компонентов в постсинапсе (рис. 6). Одним из наиболее важных компонентов является рапсин (rapsyn), белок, который, как считается, играет роль в передаче сигналов между рецепторами АХ, MuSK, дистрогликанами и членами Src семейства цитоплазматических рецепторов тирозинкиназ. Таким образом, в нервно-мышечном соединении мутантных мышей с дефицитом рапсина происходит накопление MuSK и выборочная экспрессия гена рецептора АХ в ядре, а также формируются некоторые характерные для синапса свойства, однако не происходит накопления рецепторов АХ.|
Рис. 5. Агрин представляет собой гепаран-сульфат протеогликана большой массы (400-600 кДа). Его домены взаимодействуют с ламинином, гепаран сульфат протеогликанами (HSPGs), гепарином, дистрогликаном, интегрином, гепаринсвязывающими белками и рецепторами агрина, которые вызывают агрегацию рецепторов АХ. (А) Электронная микрофотография агрина после rotatory shadowing. (В) Схематическая диаграмма структурных и связывающихся доменов агрина цыпленка. EG -- домен, подобный эпидермальному фактору роста; FS -- домен, подобный фолиостатину; LE -- домен, подобный ламинину EGF; LG -- домен, подобный ламинину G; SEA -- последовательность, обнаруженная в белках спермы морского ежа, энтерокиназах и агрине; S/T -- домены, богатые серином и/или треонином. Также показаны области связывания. Глобулярные (1, 3-5) и вытянутые (2) области молекулы можно увидеть в части А. | | | |
Среди белков, которые накапливаются в ответ на изменения в синапсе под действием агрина, находится ARIA, член семейства белков нейрегулинов (neuregulin) и белки рецепторов нейрегулинов erbВ2, erbВЗ и erbВ4. Активация erbВ рецепторов в мышце приводит к экспрессии синаптических субъединиц рецептора АХ.Гораздо меньше известно о дифференцировке пресинаптической нервной терминали. Эксперименты МакМахана показали, что молекулы, прочно связанные с синаптической базальной мембраной во взрослой мышце, могут вызывать формирование активных зон в регенерирующих аксонах. Отсутствие пресинаптической специализации у мутантных мышей с дефицитом агрина и MuSK может говорить о том, что во время развития пресинаптическая дифференцировка управляется ретроградными сигналами с мышечных клеток в ответ на выделение агрина. Одним из таких ретроградных сигналов, связанных с базальной пластинкой, является ламинин2; он накапливается во время изменений в постсинапсе в ответ на агрин, и у мутантных мышей, у которых имеется дефицит ламинина2, имеются явные аномалии пресинаптической дифференцировки.|
Рис. 6. Взаимодействие агрина с MuSK запускает дифференцировку постсинаптических образований в мышечной клетке, где начинают накапливаться рецепторы АХ, рапсин и дистрогликаны Связывание агрина с MuSK требует корецептора неидентифицированного типа (MASK) и приводит к аутофосфорилированию тирозина MuSK и активации внутриклеточных киназ Src и Fyn. Активированный MuSK захватывает рапсин посредством неидентифицированного трансмембранного белка, RATL. Рапсин, в свою очередь, захватывает дистрогликан и рецепторы АХ, которые фосфорилируются по остаткам тирозина в ?-субъединице. Через взаимодействие с дистрогликаном происходит накопление большого количества дополнительных синаптических факторов (не показано). | | | |
ВыводыУ позвоночных в период эмбриогенеза происходит диффузия протеинов из Шпемановских организационных центров, что приводит к формированию нервной пластинки, края которой загибаются вверх и формируют нервную трубку.Клетки, расположенные в стенках нервной трубки, быстро делятся. Постмитотические нейроны и клетки-предшественники глии мигрируют в различных направлениях с вентральной поверхности нервной трубки и образуют ЦНС.Миграция нейронов происходит вдоль радиально расположенных глиальных клеток и клеточных путей, обозначенных различными метками на поверхности клеток и компонентами экстраклеточного матрикса. Конечное идентифицирование клеток определяется их происхождением и индукционными взаимодействиями с другими клетками.Гомеотические гены являются управляющими генами, которые контролируют и координируют экспрессию групп других генов и, таким образом, определяют формирование различных частей тела.Литература:1. Gilbert, S.F. 2000. Developmental Biology, 6th Ed. Sinauer Associates, Sunderland, MA.2. Levi-Montalcini, R. 1982. Developmental neuro-biology and the natural history of nerve growth factor. Anny. Rev. Neurosci. 5: 341-362.3. Lumsden, A, and Krumlauf, R. 1996. Patterning the vertebrate neuroaxis. Science 274: 1109-1115.4. McAllister, A.K., Katz, L. C., and Lo, D.C. 1999. Neurotrophins and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 22: 295-318.
|
|
|
|
